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各種裂解液中的破膜組分的功能

作者： 小布丁大更新時間：2024-07-26

各種裂解液中的破膜組分主要用于細胞裂解，以便釋放細胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子。細胞裂解液的主要目的：1.利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白變性使其穩(wěn)定；4. 抑制蛋白酶活性 

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關(guān)于去垢劑 (detergents)：

幾種組織/細胞裂解液裂解強度(應(yīng)用)的差異主要還是配方中去污劑種類和濃度的不同。去污劑分為變性去污劑(denaturing detergents)和非變性去污劑(non-denaturing detergents)，前者可以是陰離子，比如SDS；或陽離子，比如乙基三甲基溴化銨。這些去垢劑總體來說破壞膜和通過打破蛋白-蛋白間相互作用來變性蛋自；非變性去垢劑分為非離子，比如Titon X-100；膽鹽，比如膽酸鹽類；和兩性離子去垢劑，比如CHAPS。

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不同類型的裂解液和其破膜組分具有不同的功能和特點：


1. 非離子型和兩性離子型去污劑（如Triton X-100, Tween 20, NP-40）
? 破壞細胞膜的脂質(zhì)雙層，但通常不會破壞細胞器膜。
? 保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，適合用于需要保留蛋白質(zhì)活性的實驗，如免疫沉淀和酶活性測定。


例如，在免疫沉淀或ELISA實驗中，Tween 20常用于洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，以減少背景信號，提高實驗的特異性和靈敏度。在蛋白質(zhì)提取和純化過程中，可以防止蛋白質(zhì)的非特異性吸附和變性，幫助保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。CHAPS常用于保持蛋白質(zhì)活性和結(jié)構(gòu)的同時破裂膜結(jié)構(gòu)，適用于功能分析。Digitonin作為一種溫和的去污劑，可以選擇性地溶解包含膽固醇的膜，如細胞膜和線粒體外膜，但對線粒體內(nèi)膜影響較小。這使得它特別適合用于區(qū)分和分離線粒體外膜和內(nèi)膜。常用于選擇性地提取線粒體外膜，同時保持內(nèi)膜的完整性。相比于其他去污劑，Digitonin的作用較為溫和，能夠在保持蛋白質(zhì)活性的同時提取膜蛋白，這對于需要保留蛋白質(zhì)功能的實驗非常重要。NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。 

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，溶解脂質(zhì)，增加細胞膜的通透性，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）。但是去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素。


2. 陰離子型去污劑（如SDS, Deoxycholate）：

? 能有效溶解細胞膜及蛋白質(zhì)，常用于徹底裂解細胞，提取總蛋白質(zhì)。
? 會使蛋白質(zhì)變性，適合用于SDS-PAGE和Western Blot等實驗。

例如，去氧膽酸鈉能有效地破壞細胞膜和核膜，廣泛用于總蛋白質(zhì)提取。在裂解細胞和組織時，它能夠幫助溶解細胞膜中的脂質(zhì)成分，釋放細胞內(nèi)容物。因此，常用于溶解和提取膜蛋白。相比于非離子型去污劑，它能夠更加徹底地溶解難以提取的膜蛋白。

SDS屬于陰離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細胞完全破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。 

去氧膽酸鈉有時與其他去污劑（如SDS）聯(lián)合使用，以增強去污和蛋白質(zhì)溶解效果。在某些情況下，與非離子型去污劑（如Triton X-100）聯(lián)合使用，可以兼顧蛋白質(zhì)溶解和活性保持。


常見的細胞裂解液成分：

50mM Tris-HCl pH7.4        (緩沖體系)

150mM NaCl                     (等滲體系)

1mM PMSF                        (蛋白酶抑制劑)

1mM EDTA                         (變性劑和穩(wěn)定劑)

5μg/ml Aprotinin                (蛋白酶抑制劑)

5μg/ml Leupeptin               (蛋白酶抑制劑)

1% Triton X-100                 (弱變性劑)

0.1% SDS                           (強變性劑和溶解劑)

1% Sodium deoxycholate   (中度變性劑和溶解劑)


一些常用裂解液的主要特點和差異：

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  • 用于普通的Western、IP或co-IP，通常使用Western及IP細胞裂解液。裂解細胞或組織后，沒有非常粘滯的透明狀DNA團塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測。

  • 對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。

  • 對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強、中)或SDS裂解液。

  • 用于特定用途需要自行添加特定抑制劑或不需要添加抑制劑時，可以考慮最后兩種。用Western及IP細胞裂解液（無抑制劑）在很多時候可以兼容酶活性和生物小分子的檢測，對于特定的酶或生物小分子的檢測是否兼容需要自行測試。Western及IP細胞裂解液（無抑制劑）的裂解能力比RIPA裂解液（強，無抑制劑）弱一些，但用于酶活性和生物小分子時，兼容性通常會更好一些。

蛋白酶抑制劑：抑制蛋白酶的活性，避免蛋白過度降解。

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磷酸酶抑制劑：抑制去磷酸化作用

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3. 裂解酶（如Lysozyme, Trypsin）：
? 針對特定類型的細胞，如細菌細胞，能夠降解細胞壁成分，使細胞膜易于裂解。
? 常與其他裂解劑聯(lián)合使用，增強裂解效果。

4. 機械破碎法（如超聲波裂解、玻璃珠研磨）：
? 不依賴化學(xué)裂解液，適用于堅硬的細胞壁（如酵母和植物細胞）。
? 可通過控制處理強度和時間調(diào)節(jié)裂解效果。

5. 高滲或低滲裂解（如低鹽緩沖液）：
? 利用滲透壓差導(dǎo)致細胞脹裂或收縮破裂，適合裂解脆弱的細胞類型。
? 通常配合其他裂解方法使用，以提高效率。

6. 有機溶劑（如乙醇、乙酸乙酯）：
? 能溶解脂質(zhì)膜，但可能對蛋白質(zhì)有較大破壞作用。
? 適用于某些特定實驗，如脂質(zhì)分析。

選擇合適的裂解液及其破膜組分，取決于具體的實驗?zāi)康暮图毎愋?。確保實驗條件不會破壞目標分子的活性或結(jié)構(gòu)，是進行成功實驗的關(guān)鍵。



1.細胞裂解液影響細胞膜和核膜的破壞效率， 所以應(yīng)根據(jù)目標分子在細胞內(nèi)的定位選擇裂解液。此外，不同的細胞和組織具有不同的膜組成和結(jié)構(gòu)，需要針對其特性選擇特定裂解液。使用錯誤的細胞裂解液可能導(dǎo)致細胞裂解不完全，進而影響數(shù)據(jù)的準確性。

2.適當?shù)牧呀庖簩τ诰S持細胞內(nèi)目標分子的穩(wěn)定性和完整性至關(guān)重要。例如，在核酸研究中，裂解液會影響RNA、DNA及其修飾的完整性。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，它影響蛋白質(zhì)和翻譯后修飾的穩(wěn)定性。使用錯誤的緩沖液可能導(dǎo)致這些分子的降解或變性，從而損害下游分析的準確性。

3.細胞裂解液對試驗結(jié)果的一致性有重要的影響。不同的緩沖液pH值、離子強度和去垢劑不同，這些因素可能影響酶、蛋白質(zhì)和其他細胞組分的結(jié)構(gòu)和活性。保持緩沖液一致性對于確保實驗的可重復(fù)性至關(guān)重要。

4.選擇錯誤的裂解液會造成樣品中無目的蛋白情況，例如目的蛋白為核蛋白時請勿使用NP40這類溫和的裂解液。

5. 如果是分泌型蛋白，例如細胞因子或趨化因子等，組織或者細胞的裂解液可能并不能直接反映目的蛋白的表達水平，一方面可以通過刺激處理促進其胞內(nèi)表達，另一方面可以嘗試ELISA或者Luminex多因子檢測等實驗方法對細胞上清液或者生物體液等進行檢測。此外，樣本收集及保存過程中，需要考慮目的蛋白降解的風(fēng)險，建議使用新鮮的裂解液對新鮮收集的樣本進行蛋白提取，并確保裂解液中蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑活性，防止蛋白降解。樣本盡量低溫保存，并避免反復(fù)凍融。


（來源 微信公眾號：“科研這點事兒”）